Nat Comm | FAM50A突变提示Armfield XLID综合征是一种剪接体病
在人群中约1-3%的人受智力障碍（ID）影响，由于X染色体上富集了神经发育所需的基因，因此在ID人群中男性比女性多20-30%。在全球范围研究人员的努力下已经确认了145个基因与X染色体连锁智力障碍（XLID）综合征相关，但是仍有相当数量的XLID综合征仍然没有明确致病基因。尽管Armfield XLID综合征已被定位在Xq28的一个8Mb区域上，但是其关键致病基因仍未明确。来自韩国、美国等国学者在Armfield XLID综合征患者中鉴定了FAM50A上的罕见错义变异并通过斑马鱼fam50a-KO模型的研究，明确了Armfield XLID综合征是一种由于FAM50A变异引起的与发育过程中mRNA加工异常有关的剪接体病。该项研究结果于2020年7月23日发表在NATURE COMMUNICATIONS上，题目为《Mutations in FAM50A suggest that Armfield XLID syndrome is a spliceosomopathy》。
研究结果：Armfield XLID综合征患者携带FAM50A上的罕见变异
在K8100家系中有多名男性成员表现为Armfield XLID综合征，通过对受累男性中位于Xq28的五个候选基因（GDI1, MECP2, L1CAM, AFF2/FMR2, FAM50A/XAP5）的外显子和外显子-内含子边界进行了双向Sanger测序、X染色体718个基因测序、X-exome测序确定了FAM50A基因的错义突变，即c.764A> G (p.Asp255Gly)为该家系男性成员致病的唯一候选变异。同时通过GeneMatcher纳入了4例携带FAM50A变异的男性进行后续研究（图1）。
在这5个不相关的家系中共有9名男性携带FAM50A的罕见变异，他们均具有ID综合征和发育迟缓、面部畸形和眼部发育异常的共病表型。这5个错义变异通过生物信息学分析变异可能是致病的，同时蛋白质建模也表明这5个错义变异可能影响蛋白质结构的稳定性。胎儿脑组织cDNA的半定量结果表明FAM50A在小脑和下丘脑中表达较高，在颞叶中低表达，在海马组织中无表达。FAM50A蛋白的表达和细胞定位结果表明FAM50A蛋白定位在细胞核内，并且错义变异不影响蛋白的表达水平和蛋白定位。
图1 在五个不相关的家系中FAM50A的错义变异及患者表型
fam50a-KO斑马鱼重现与患者相关的表型
为了确定FAM50A缺失的表型，本研究使用CRISPR/cas9技术构建了斑马鱼FAM50A基因敲除模型。fam50a-KO斑马鱼在3 dpf时表型与野生型一致，但在5 dpf时KO幼鱼表现出颅面发育异常。对斑马鱼的神经发育检测发现KO幼鱼神经元分化减少、细胞凋亡标记基因表达升高、软骨发育严重缺陷（图2）。fam50a-KO斑马鱼的表型提示了Armfield XLID综合征患者中存在的特定的早期神经发育缺陷。
图2：fam50a-KO斑马鱼显示中枢神经系统发育缺陷并重现患者颅面畸形
fam50a-KO斑马鱼的基因表达谱改变并且mRNA异常剪接事件增加
研究人员提取幼鱼头部组织RNA进行转录组测序，以评估KO与WT的基因表达谱差异。与野生型相比，fam50a-KO中约有12％的基因（2804个基因）表达水平发生了显着改变，其中48％被下调（1359个基因）和52％被上调（1445个基因）。在KO中显著下调的通路参与神经发育、脑功能和软骨发育，而显著上调的通路则参与mRNA的加工或剪接（图3 a，b，c）。针对转录组数据进行的剪接分析表明在KO斑马鱼中异常剪接事件显著增加，并且受影响最大的是3’剪接事件（n=235，49％），然后是外显子跳跃事件（n=145，30％），GO分类中的重要基因聚类如RNA结合基因、DNA结合基因等的异常剪接也主要是3’剪接位点的改变（图3d，e）。转录组数据分析表明FAM50A变异导致mRNA加工效应子的细胞代偿响应，并且神经发育和软骨发育相关的生物过程特别容易受到FAM50A功能丧失的影响，FAM50A变异剪接异常偏向于3’剪接位点改变或外显子跳跃。
图3：RNA-seq分析揭示了fam50a-KO斑马鱼中的mRNA剪接改变
FAM50A与剪接体U5和C复合蛋白相互作用
已有的亲和纯化复合物研究和体外研究表明FAM50A是潜在的剪接体蛋白，参与mRNA的结合。为了验证FAM50A与剪接体C复合物的潜在联系，研究者通过FAM50A pull-down，然后进行纳米级液相色谱-串联质谱分析。经鉴定，在捕获的FAM50A相互作用的蛋白中，有20个蛋白涉及RNA加工，其中与U5-snRNA结合最显著。同时通过免疫共沉淀（co-IP）验证了FAM50A与剪接体效应子的直接相互作用，结果显示FAM50A与剪接体结合伴侣的特异性相互作用。结合转录组数据结果，FAM50A功能丧失导致的剪接体C复合体功能异常可能是Armfield XLID的分子机制。
图4：FAM50A与剪接体结合伴侣U5和C复合蛋白的特异性相互作用
总 结:
智力障碍是一种临床异质性疾病，约1-3%的人受累。Armfield XLID综合征致病区域定位在Xq28的8Mb区域已20年，但是其关键致病基因仍未有报道。该研究通过对患者进行致病区域关键基因变异筛查并结合斑马鱼模型的研究，明确了FAM50A为Armfield XLID综合征的关键致病基因，同时表明Armfield XLID综合征是一种与发育过程中mRNA加工异常有关的剪接体病。遗传病的致病机制复杂多样，已经描述约9000多种孟德尔表型中，基因-表型的关联建立仍需要模式动物研究和体外功能实验结合起来。赛福转化医学实验室通过一对一的个性化服务模式，为医生提供基因功能验证的整体解决方案。
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